Genen tellen met streepjescodes

21 sep, 2018

NanoString ontwikkelde een microscoop die individuele moleculen zoals RNA of eiwitten op een stukje weefsel in beeld kan brengen, identificeren en tellen. De belofte is: sneller dan sequencen en goedkoper dan veel andere kwantitatieve imagingtechnieken. NKI mag als een van de eersten ter wereld het apparaat gebruiken voordat het op de markt komt.

“Dit gaat heel groot worden,” zegt Patrick van Houts van nanoString met nauwelijks verholen trots. “Onze nCounter-technologie kan onder andere q-PCR al voor veel toepassingen vervangen. Het nieuwe platform Digital Spatial Profiling is daarop een aanvulling. En in de toekomst staat toepassing in spatiële genomics ook op het programma.”
De nanoString-technologie geeft al kwantitatieve informatie over bijvoorbeeld genen en eiwitten in een monster. Maar niet alleen de samenstelling, ook spatiële informatie is belangrijk bij onderzoek naar bijvoorbeeld kanker. Waar in de tumor bevinden zich bijvoorbeeld de eiwitten? “Bestaande technieken geven je een keuze: wil ik multiplexing, dus veel verschillende genen of eiwitten meten? Of wil ik weten waar een gen of eiwit zich bevindt in het weefsel? Bovendien: de meeste technieken vernietigen het kostbare patiëntenmateriaal,” zegt Van Houts.

Zuiver meten
Digital Spatial Profiling (DSP) geeft onderzoekers de mogelijkheid in theorie honderden targets zoals genen of eiwitten tegelijk te bepalen op een zelf of automatisch gekozen deel van een biopt, bijvoorbeeld van een tumor of stroma. Bij eiwitanalyse kan het biopt na de analyse opnieuw worden gebruikt. DSP maakt gebruik van de nCounter streepjescodetechnologie die Nanostring ontwikkelde (zie kader). “Begin 2017 was er het proof of concept,” vertelt Van Houts. “We zijn begonnen met antilichamen voor eiwitdetectie, waarvan we er op dit moment 96 tegelijk kunnen meten.”
Uniek is de reproduceerbaarheid van de nanoString nCounter® methode, zegt Van Houts. “Die ligt op 97 tot 99%, zelfs tussen verschillende apparaten en verschillende onderzoekscentra. Dat is onder andere te danken aan de directe hybridisatie zonder tussenkomst van enzymen en amplificatiestappen die we hanteren, en door het ‘digitale’ karakter van de meting: een gen is er óf wel, óf niet. Immunofluorescentie bijvoorbeeld neemt de intensiteit van de fluorescentie als maat voor de aanwezigheid van een gen. Dat is een variabele schaal.”

Voorsprong
Momenteel worden er wereldwijd acht centers of excellence ingericht die met eigen onderzoek de technologie gaan valideren. Begin 2019 volgt de commerciële introductie van de apparatuur. Het NKI in Amsterdam is één van deze centers. Christian Blank, hoogleraar moleculaire oncologie en immunologie aan het NKI is blij met deze kans: “Als eerste in Europa krijgen we eind 2018 zo’n microscoop en we werken al enige tijd met een proefmodel elders. We hebben dus straks een jaar voorsprong in ervaring en expertise. Volgend jaar zullen wij core facility worden, zodat we voor andere groepen binnen en buiten het NKI samples kunnen meten.”
Blank is enthousiast over de technologie. “Het is een heel interessante techniek omdat je met één slide heel veel verschillende markers kunt meten. Dat spaart veel materiaal. Bovendien krijg je informatie over de positie van de markers. Het blijkt bijvoorbeeld dat twee biomarkers die dicht bij elkaar op een tumor zitten een goede voorspeller zijn voor relapse, een terugkeer van de tumor na behandeling. Zitten ze ver van elkaar, dan is dat risico kleiner. Alternatieve technieken voor dit soort bepalingen zijn extreem duur en maken het weefsel kapot.”
Blank doet onder andere onderzoek naar immuuntherapie voor melanoom. Immuuntherapie is pas effectief als immuuncellen op of in de tumor zitten, wat immune hot wordt genoemd. Met DSP detecteerden de onderzoekers tientallen biomarkers op specifieke plekken van de tumor. Daaruit bleek zoals verwacht dat tumoren die immune cold zijn vaker terugkeren na behandeling. Blank zegt: “Dit is geen rocket science, maar het laat wel zien dat je heel snel veel biomarkers kunt meten en daarbij het weefsel spaart. Dit type onderzoek gaan we voor andere ziekten voortzetten met DSP. Er is geen andere techniek waarmee we dat zouden kunnen doen.”

Hoe werkt Digital Spatial Profiling?
Het jonge bedrijf nanoString ontwikkelde de zogeheten nCounter® barcode-technologie waarmee high throughput genexpressieanalyse in enkele dagen klaar is in plaats van weken zoals met RNA sequencing.LT1809_Nanostring_Workflow_Chemistry-02_captions.jpg

De barcode bestaat uit een reeks van zes ‘streepjes’ van vier soorten fluorescente moleculen (of ‘kleuren’). Uit zes moleculen van vier kleuren kun je duizenden unieke combinaties maken. Elke combinatie wordt verbonden aan een DNA-oligomeer van 50 nucleotiden lang dat complementair is aan een stukje van het target (bijvoorbeeld een gen) naar keuze. Dat is de zogeheten ‘reporter probe’. Daarnaast is er een capture probe met eveneens een DNA-oligomeer van 50 nucleotiden lang en een biotine-molecuul aan het uiteinde. Beide stukjes binden specifiek aan het target (bijvoorbeeld doel-RNA).

Nanostring_Workflow_Chemistry-04-captions.jpg

 

Daarna bindt het biotine van de capture probe het probe-target complex aan een streptavidine-oppervlak. Alle niet-gebonden materiaal wordt weggespoeld zodat er aan het oppervlak stukjes RNA vastzitten met per target een unieke kleurcode.

 

 

Nanostring_data_04.jpg

 

Een microscoop maakt een opname van het oppervlak en de software telt vervolgens hoeveel van welke kleurcodes op het plaatje zitten. Dat levert een lijst op met aanwezige targets met het aantal daarvan per target. Het hele proces duurt slechts enkele uren plus voorafgaand hieraan een nacht wachten voor het binden van de probes aan de targets.

 

 

Digital Spatial Profiling gebruikt de voordelen van de nCounter-technologie, en past deze toe bij spatiële weefselanalyse in de pathologie. Voor eiwitdetectie worden daarvoor unieke DNA-tags met een UV-gevoelige linker aan de antilichamen gebonden. Het weefsel wordt weer behandeld met de antilichamen en ongebonden materiaal weggespoeld. Daarna kun je met honderdduizenden individueel aan te sturen microspiegeltjes kiezen op welk deel van het weefsel UV-licht schijnt. Daar laat de DNA-tag los van het gebonden antilichaam en wordt met een capillair opgezogen en overgebracht naar een sample-plaat die met een standaard nCounter-systeem uitgelezen kan worden. Zo kun je dus precies bepalen van welk deel van de tumor je de analyse wil doen.